DNase I（RNase-free）

●  產品組成：

● 保存： -20℃貯存，有效期一年。

● 產品簡介：

DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基。 DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下， DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I  可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。該DNase I不含RNase (RNase free)，可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。

用途：制備不含DNA的RNA樣品；RT-PCR反應前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染；體外T7, T3, SP6等RNA  Polymerases催化的RNA轉錄后去除DNA模板；DNase I footprinting研究DNA-蛋白質相互作用；缺口平移(nick translatioin)；產生DNA隨機片段文庫；細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照。

● 活性定義：

One unit of the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C. 

● DNaseI貯存緩沖液：

50mM Tris-acetate (pH7.5)，10mM CaCl₂，50% (v/v) glycerol

10×DNase Reaction Buffer：100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，25mM MgCl₂，1mM CaCl₂

● DNaseI失活或抑制：

加入EDTA至終濃度為2.5mM后，65℃加熱10分鐘可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑，達到毫摩爾/升濃度的鋅離子，0.1%的SDS，DTT、巰基乙醇等還原劑，50-100mM以上鹽濃度均對DNase I有顯著抑制作用。

● 使用方法：

一 RT-PCR反應前RNA樣品中DNA的去除：

 1.在RNase-free離心管中加入以下溶液：

2. 37oC 孵育 30 分鐘。

3. 向上述反應體系中加入 1μl 10×EDTA終止液，65oC 孵育 10 分鐘以失活 DNase I。

注：在沒有鏊合劑如 EDTA存在情況下加熱，RNA 可被水解。

4. RNA樣品即可直接用作RT-PCR反應的模板。

二 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除：

1.  在每含有0.5 μg模板DNA的反轉錄反應體系中加入1U DNase I。

注：在某些情況下，模板DNA完全消化所需的DNase的量需通過實驗進行摸索。

2.  37oC  孵育15分鐘。

3.  酚/氯仿抽提失活DNase I。

三 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除：

1.  參考如下表格設置反應體系：

*3 dNTP Mixture (1mM  each, without the labeled dNTP)：分別取不含已經標記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM)  各 1μl 加入到 97 μl 的RNase-free水中混勻即可。例如標記的為 dATP，則需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三種 dNTP 至每種的最終濃度為 1 mM。配制好的 dNTP 可存放于-20oC 以備后續(xù)使用。

**DNase I 可以用 1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進行稀釋。

10×Reaction Buffer for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，100mM MgCl₂，10mM DTT。

2. 立即 15oC 孵育 15~60 分鐘。

3. 上述反應體系中加入1 μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應。

4. 從中取出少量例如1 μl 檢測標記效率。通常標記效率至少可以達到 10⁸cpm/μg DNA。